激光共聚焦顯微鏡是近代生物醫(yī)學(xué)圖象儀器。它是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針。 利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖象，以及在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化。
下面讓我們一起來(lái)了解一下激光共聚焦顯微鏡的原理是什么吧。
在普通寬視野光學(xué)顯微鏡中，整個(gè)標(biāo)本全部都被水銀弧光燈或氙燈的光線(xiàn)照明，圖像可以用肉眼直接觀察 。
同時(shí)，來(lái)自焦點(diǎn)以外的其他區(qū)域的熒光對(duì)結(jié)構(gòu)的干擾較大，尤其是標(biāo)本的厚度在 2um 以上時(shí)，其影響更為明顯。
激光共聚焦顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場(chǎng)光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束經(jīng)照明針孔，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對(duì)標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。
組織樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質(zhì)，受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經(jīng)原來(lái)入射光路直接反向回到分光鏡，通過(guò)探測(cè)針孔時(shí)先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管(PMT)探測(cè)收集，并將信號(hào)輸送到計(jì)算機(jī)，處理后在計(jì)算機(jī)顯示器上顯示圖像 。
在這個(gè)光路中，只有在焦平面的光才能穿過(guò)探測(cè)針孔，焦平面以外區(qū)域射來(lái)的光線(xiàn)在探測(cè)小孔平面是離焦的，不能通過(guò)小孔。因此，非觀察點(diǎn)的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。
由于照明針孔與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔與探測(cè)針孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測(cè)針孔處成像，即共聚焦。
以激光作光源并對(duì)樣品進(jìn)行掃描，在此過(guò)程中兩次聚焦，故稱(chēng)為激光掃描共聚焦顯微鏡。
